Enredando por Internet, he dado con una publicación del año 2.005 de un autor de Michigan (USA):
Richard W. Dapson:
“Dye-tissue interaction: mechanism, quantification and bonding parameters for dyes used in biological staining”.
Se trata de un interesante y amplio estudio de los factores físico-químicos que intervienen en el enlace de los colorantes y los tejidos, con la aportación además de un Indice Hidrofóbico (HI).
Al comienzo de la página 55 (de Biotechnic & Histochemistry 2005 80(2): 49-72), Dapson deja claro el ámbito de su estudio: “The present study is restricted to bonding mechanisms, but other factors such as diffusion and reaction rates also are important as the references cited above so ably explain”, cosa que es de agradecer y que no hacen otros muchos autores, para los que parece que sus estudios son de aplicación para todo.
La tabla que adjunta es muy completa, aportando todos los índices que son calculables mecanocuánticamente. No puede abarcar algunos casos (muy pocos) por exceso de tamaño molecular u otros factores.
En el texto se hace un estudio detallado de la influencia que puede tener cada índice en el poder colorante de los compuestos. Así, se repasan tamaño, carga, grupos capaces de ionizarse, capacidad de formación de Enlaces de Hidrógeno, momento dipolar y polarizabilidad, capacidad de constituir estructuras resonantes e hidro y liposolubilidad.
Concretándome a los colorantes que habitualmente manejo, de los índices que contiene la tabla, el que quizá sirva mejor para diferenciar unos de otros sea el HI, seguido del tamaño molecular.
Destacan así, con un HI más bajo (HI<3), algunos colorantes de los habitualmente denominados “ácidos”:
Rojo Congo, Verde Rápido, Fucsina ácida...
frente a otros clásicamente “básicos” (con HI>6):
Verde Malaquita, Verde Brillante, Violeta de Genciana, Safranina O.
La Hematoxilina, siempre un tanto anómala, queda en un “aparte”, y los Azules de Astra y de Alcián pasan a engrosar el cuerpo de los “ácidos” con su gran tamaño y la existencia en su núcleo de un átomo metálico.
Sobre la formación de los enlaces covalentes e iónicos en las coloraciones:
Los razonamientos teóricos de los histopatólogos sobre los enlaces que se forman cuando se producen tinciones en los tejidos se han dirigido tradicionalmente hacia la formación de enlaces con proteínas, con las posibles interacciones con los grupos -COOH y -NH₂, aunque pocas veces las reacciones acaban con la formación de verdaderos enlaces covalentes (Reactivo de Schiff para aldehídos, Reacción de Feulgen para ADN...). Estas coloraciones proporcionan datos de utilidad diagnóstica y clínica.
Difícilmente esto es extrapolable al campo de lo vegetal, ya que la estructura de la pared de la célula vegetal es muy diferente a la de los tejidos animales. En la célula vegetal el esqueleto es una estructura eminentemente glucosídica: fibras de celulosa, hemicelulosas y pectinas, y sólo en la matriz celular (el “cemento” que rellena el esqueleto) hay proteínas o glucoproteínas.
Respecto al tratamiento de los enlaces iónicos, también es de utilidad en el estudio de histopatología animal y humana la influencia selectiva del pH en la ionización de los grupos carboxilo, sulfónico y amino, pero esto tiene solo una relativa utilidad práctica para la microtécnica botánica aficionada.
Queda pues, para la interpretación del fenómeno de tinción de estructuras vegetales, la influencia de las Fuerzas de van der Waals e intermoleculares (dipolo-dipolo y dipolos inducidos: Kaesom, Debye y London), todas ellas interacciones mucho más sutiles que los enlaces covalentes y iónicos y por lo tanto dado a interpretaciones mucho más discutibles.
Resta por tanto, para el aficionado, la apasionante labor de la prueba experimental basada en la experiencia propia y ajena, guiada, eso sí, por las sugerencias e insinuaciones teóricas. Debe quedar claro que una cosa es la detección inequívoca de un tipo de tejido o sustancia y otra la consecución de una imagen de un corte más o menos completo con características estéticas agradables.
Además de los índices que aporta la extensa tabla y los razonamientos físico-químicos, otros factores son de amplia influencia en el resultado final de la tinción vegetal. Y hago especial incapié en la palabra final ya que la tinción es el resultado de toda una cadena con muchos eslabones:
Colecta, conservación, fijación, fraccionamiento y corte (e inclusión en su caso), tinción, diferenciación, montaje, visionado, almacenamiento, fotografiado...
Todos influyen en el resultado final, y cada uno de ellos en los pasos posteriores.
Muchos autores clásicos (Langeron, Sass, Pujiula, Castellarnau...) han insistido en alertar de los posibles inconvenientes de una determinada fijación para la posterior coloración, o de la influencia de un buen lavado que garantice la ausencia de restos de productos procedentes de los fijadores o conservadores. Esto, unido al factor tiempo (falta de paciencia, precipitación, distracciones...) puede hacer que los resutados sean dispares tanto en el tiempo (lo que uno hace en distintos días) como en el espacio (lo que hacen diferentes aficionados en distintos sitios).
La coloración es una interacción color-tejido, y por tanto, además de estudiar el colorante, también debemos tener en cuenta las características de los tejidos que pretendemos teñir. No es lo mismo un tallo joven que un tallo de esa misma especie pero con varios años ( o menos) de crecimiento. Ni el tallo de primavera que el de otoño. Ni el corte dado cerca del ápice que el realizado próximo a la base. El vegetal se encarga, por la cuenta que le tiene, de acomodar la composición de su estructura a la edad, nicho ecológico, anatomía, fisiología, etc.
Distintos tipos de ligninas
Muchas veces observamos que la lignina de las fibras corticales de refuerzo de algunos tallos se tiñen de distinto tono que la lignina de los vasos xilemáticos. ¿Se trata de la misma lignina? Claramente, no. Aunque en los dos casos la función de la lignificación es de “refuerzo”, por los vasos va a fluir la savia y por las fibras no, por tanto no debe extrañarnos que la composición sea distinta.
Las ligninas son productos heterogéneos, dentro de su composición polifenólica, con distintas proporciones de ácidos cumarílico, coniferílico y sinapílico, así como infinitas posibilidades de uniones tridimensionales entre ellos. Los colorantes “básicos” se enganchan con fuerza a esa trama tridimensional. Con tanta fuerza que a veces cuesta trabajo extraer el color incluso con Alcohol Clorhídrico, reactivo al que se recurre en algunas diferenciaciones. Tanto en la coloración (penetración – difusión del colorante desde la solución tintórea hacia el tejido) como en la diferenciación (paso del colorante desde el interior del tejido al disolvente) influyen factores como: concentración, temperatura, lipo o hidrosolubilidad del colorante y del líquido diferenciador, agitación, luz...
Incluso me atrevería a considerar la influencia de la presión atmosférica y su variación, pues si el día está tormentoso... los nervios del microscopista podrán también influir en el resultado.
Otros factores “extracientíficos” también son a tener en cuenta.
Veamos: hay tinciones que se utilizan para la confirmación de una estructura o composición, como por ejemplo la detección de celulosa con Lugol y Ácido Sulfúrico al 80% o la detección de ligninas con Floroglucina y Clorhídrico, y que una vez realizadas dejan la preparación inservible ya que los tejidos se descomponen por la acción de los reactivos. Son tinciones muy buenas histológicamente pero no valen para hacer una colección de preparaciones teñidas. No permanecen en el tiempo. Hoy en día, como se ha facilitado mucho hacer fotografías con microscopio, podemos hacer fotos de la preparación nada más realizada la coloración y guardar el archivo como jpg o bmp (ahora ya no hace falta guardar la foto en papel). Son fotos irrepetibles...
Algo similar ocurre con algunas tinciones metacromáticas, que son muy bellas al principio pero con el tiempo (a veces breve) no se puede evitar que degeneren a preparaciones sin contraste alguno. La Safranina acuosa produce en ciertos tejidos una bonita metacromasia, pero solo “aguanta” en Agua o en Silicato Sódico.
Campanula teñida con Safranina aq montada en Silicato
En cuanto se monta en medios acuosos que contengan Glicerina se embadurna todo. He probado hasta once medios distintos sin éxito, salvo los dos indicados, y aun así con dudosa durabilidad.
En general, los medios de montaje resinosos son más duraderos que los acuosos, y en general también, los resultados son mejores cuanto más tiempo y esfuerzo hay que poner en el proceso.
¡Pero conviene encontrar un equilibrio entre la perfección conseguida con gran esfuerzo y un aceptable resultado práctico con comodidad y rapidez!.
A ello van dirigidas las tinciones bi y tricrómicas simultáneas del tipo FA11, AFA, SAFLAST, FAN que vengo utilizando, con las que, con una sola inmersión del corte en la mezcla correspondiente, se pueden obtener resultados correctos y bellos, sin tener que recurrir a modus operandi complejos, disolventes raros o diferenciaciones críticas.
Las CUATRO mezclas anteriormente citadas funcionan con Agua, Isopropanol y Montajes Resinosos sin mayor problema. Son simplemente mezclas más o menos empíricas que con el tiempo compruebo que son similares a las de otros autores.
Al final se muestran las Composiciones y el Modus Operandi aproximado, así como algunas fotografías de ejemplo. La media de tiempo invertido en hacer una preparación no excede los 15 minutos. Si se quieren “preciosidades” véanse los trabajos de los colegas alemanes de Mikroscopische K. Bonn: R. Wacker, K. Henkel ... con ETZOLD FCA, W3A, ACRIBEN,...
¡PERO OJO! Que nadie espere buenos resultados si TODOS LOS ESLABONES de la cadena no han sido debidamente cuidados.
¡Siempre podremos estropear una buena coloración con un mal montaje y nunca podremos enderezar un mal corte por muy buena que sea la técnica de coloración!
En términos taurinos, ¡Suerte... y al Tinte!
COMPOSICIONES y MODUS OPERANDI
FA11 FUCSINA BÁSICA 0,5% aq 1 p
AZUL DE ASTRA (Euromex) 1 p
AFA211 FUCSINA BÁSICA 0,5% aq 1 p
AZUL DE ASTRA (Eu) 1 p (O lo que es lo mismo, partes
ACRIFLAVINA (NT) 2 p iguales de FA11 y ACRIFL.)
SAFLAST SAFRANINA 0,5% aq 1 p
ACRIFLAVINA (NT) 3 p
AZUL DE ASTRA (Eu) (diluido 1:3 en agua) 5 p
FAN FUCSINA BÁSICA 0,5% aq 1 p
AZUL DE ASTRA (Eu) 1 p
NARANJA DE ACRIDINA 1% aq 2 p
Los productos son todos asequibles por Internet.
Las proporciones son orientativas, no críticas, y pueden variar en función del tiempo de inmersión en la mezcla, que va de 3 a 5 minutos, pudiendo acoplarse a cada caso en funcion del tipo y grosor de corte.
MODUS OPERANDI GENERAL:
Corte en agua
Corte en Mezcla colorante
Lavado en agua
Lavado en IPA (Isopropanol)
Deshidratación: Paso de IPA a IPAXIL (mezcla de IPA y XILOL a partes iguales)
Xilol
Montaje en Resina (Dammar, Bálsamo...)
Siempre será preferible lavar tres veces en vez de una, tanto en agua como en alcoholes, pero la norma mejor es lavado HNC, acrónimo de Hasta No Cesión, es decir, hasta que el corte deje de soltar colorante al disolvente.
4 EJEMPLOS CON LAS 4 MEZCLAS
Chondrilla juncea Teñido con FA11.
Todos los cortes se han hecho con el Microtomo Estocástico
Serán bien recibidos todos los comentarios AGS MARZO 2021.
