FÁCIL TINCIÓN DOBLE SIMULTÁNEA DE CORTES VEGETALES

FÁCIL TINCIÓN DOBLE SIMULTÁNEA DE CORTES VEGETALES

Las tinciones dobles diferenciales de tejidos vegetales se basan en la acción sucesiva de dos o más colorantes intercalando una diferenciación con Etanol o con Alcohol Clorhídrico y uno o varios pasos por series de alcoholes etílicos de concentración creciente.

Así son, por ejemplo, las tinciones de Johanssen, Sass, Gürr, Mirande y otros.

Se propone aquí una tinción doble, rápida y realizada con una sola disolución colorante (en realidad mezcla de dos) y un solo disolvente.

El colorante, de diseño propio, es el que he dado en llamar SAVI-01 (acrónimo de su composición), cuya fácil elaboración puede verse al final de esta comunicación.

El disolvente es el Isopropanol (IPA), cuyas bondades ya expuse en la primera exposición de este Blog.

El resultado se muestra en las fotografías adjuntas. El contraste entre tejidos celulósicos y lignificados considero que es bueno, y la conservación de los colores y las preparaciones ha sido satisfactoria al menos durante ocho meses. También la disolución colorante se ha mantenido correctamente durante ese tiempo.

Doy por supuesto que se pueden obtener coloraciones de mayor belleza y contraste; basta observar las obtenidas por los microscopistas alemanes (http://www.mikroskopie-bonn.de/ por ejemplo) pero ellos utilizan colorantes de Acridina y Modus Operandi mucho más complejos.

Más simple que éstas últimas y casi igual de bonita es la coloración doble con Verde Brillante o Verde Yodo y Rojo Congo, pero requiere un paso intermedio de diferenciación y el Rojo Congo se comporta mal fuera del medio acuoso.

MODUS OPERANDI:

1.-  Corte en IPA, procedente del lavado necesario para eliminar el fijador y/o conservador

2.- Inmersión en SAVI-01 unos 5 minutos

3.- Lavado en IPA hasta no cesión de colorantes

4.- Montaje en Laca o Resinas

Como en todas las tinciones, los tiempos varían algo en función del material (especie, edad, conservación…)

ELABORACIÓN DEL COLORANTE:

-        Disolver Safranina en agua al 0,2%

-        Disolver Verde Rápido en IPA al 0,2%

-        Mezclar ambas soluciones a partes iguales, agitar y ya está disponible para su uso.

El nombre: SAVI-01 indica la composición: Safranina, Agua, Verde rápido, Isopropanol, y 0,1% es la concentración final de ambos.

TEÑIDO DE CORTES VEGETALES FACILITADO POR EL ISOPROPANOL

ELABORACIÓN DEL TEÑIDO DE CORTES VEGETALES  FACILITADA POR EL USO DEL ISOPROPANOL

Una de las tareas que consumen más tiempo (y dinero) del microscopista aficionado en la elaboración de preparaciones de tejidos vegetales, es la deshidratación (o hidratación) progresiva de los cortes en la serie de alcoholes con el fin de pasar de medio acuoso a oleoso y viceversa. Normalmente se utiliza una batería de alcoholes etílicos de concentración creciente: (50º, 70º, 96º y absoluto).

Si se quiere montar en resina (Bálsamo del Canadá, resina Dammar, etc.) se ha de pasar además al final por un intermedio que tradicionalmente viene siendo una esencia (clavo o naranja), pues es problemático el paso directo desde alcohol a xilol.

Todos esos pasos o gran parte de ellos pueden reducirse cómodamente olvidándose del Alcohol Etílico y sustituyéndolo por:


Alcohol Isopropílico   (Isopropanol,   propanol-2,   IPA).


El IPA es un alcohol de propiedades muy similares al etanol, ya que tiene parecido punto de ebullición e índice de refracción, es incoloro y tiene un olor no muy diferente. Su toxicidad también es similar y también se utiliza con éxito como antiséptico, pero para nosotros tiene la ventaja de su comportamiento con algunos colorantes, a los que respeta en mayor grado que el etanol.

En la práctica histológica vegetal hay coloraciones en medio acuoso (p. ej. la tinción de parenquimas celulósicos con Rojo Congo) que se desvanecen al tratar el corte con Etanol (en cualquiera de las diluciones usuales). El Isopropanol permite “congelar” la coloración para luego pasar al montaje en Laca de uñas.

No obstante, si se quiere hacer el montaje en Resinas (Bálsamo del Canadá, Resina Dammar…), una vez que el objeto está en IPA, agregamos una gota de Xilol, esperamos a que se mezclen y evaporen parcialmente, agregamos otra gota de Xilol y procedemos al montaje.

El ahorro trabajando con Isopropanol es tanto de trabajo como de dinero, ya que el Alcohol Absoluto es caro y además, en cuanto abrimos la botella, comienza a dejar de ser Absoluto (100%) para, con la humedad ambiente, convertirse en el azeótropo de 96%.

El Isopropanol tiene también la bondad, comparado con el Etanol, de no causar “desteñidos” tardíos en las preparaciones. La Safranina, por ejemplo, es muy dada a ceder color días después de hecha la preparación, cuando ésta se ha realizado con ayuda de etanol.
También este colorante vira hacia tonos fucsia en presencia de alcohol etílico. Con Isopropanol conserva mejor el color rojo propio de su disolución acuosa, aunque no mantiene el bonito rojo vivo de la Safranina en agua.


Utilizando el IPA y la Laca podemos evitarnos también la fabricación de medios de montaje acuosos, necesarios para colorantes como el Rojo Congo, ahorrándonos el trabajo de preparar geles de goma arábiga, lentos en su elaboración y problemáticos en la filtración, así como proclives a contaminarse con hongos si no agregamos antifúngicos. (El precio que a veces se paga es una pérdida en la luminosidad o una variación de tonalidad de algunos colores)




Lo que aquí se propone es una técnica rápida y sencilla, alternativa y complementaria con los métodos tradicionales de tinción y montaje tanto acuosos como resinosos. Se busca sobre todo simplificar y abaratar la técnica con el fin de animar a los principiantes.


Las  coloraciones simples se pueden hacer con cualquiera de los colorantes habitualmente utilizados: Verde Yodo, Violeta de Genciana, Rojo Congo, Hematoxilina, Safranina, Verde Rápido, Azul de metileno, etc. , pero el aficionado que comienza y no tiene facilidad de adquisición de los citados también pueden utilizar colorantes “caseros”, por ejemplo:

Merbromina (El Mercurocromo o Mercromina utilizada en la cura de heridas)
Tinta Azul (recambios de tinta Azul de las estilográficas que suele tener Azul de Metileno).
Colorante alimentario: suele ser Tartrazina
Colorantes para teñir ropa
Tinta china de color (la roja suele tener Eosina)
Azafrán
Betanina: agua de la remolacha en conserva
Etc.

(aquí se abre un apasionante campo en el que no entramos ahora: el de la extracción de colorantes naturales)


Los colorantes caseros citados arriba que ya estén en forma líquida se utilizan directamente, y los sólidos se deberán disolver en agua hasta que den coloración suficiente y se filtran por algodón o papel.



A continuación se muestran cuatro ejemplos de coloraciones obtenidas con colorantes “caseros” y el método aquí indicado sin etanol y con Isopropanol.

Corte transversal de tallo teñido
con Mercurocromo

Corte transversal de tallo teñido
con Verde Yodo

Corte transversal de tallo teñido con colorante
 para teñir ropa "IBERIA nº 32"

Corte de hoja de Cyperus teñida con
Tartracina

NOTA sobre CONCENTRACIÓN:

La concentración inicial de los colorantes podemos centrarla en 0,1% en disolución acuosa, pero es obvio que habrá que probar otras concentraciones según los casos.

En el caso concreto de Hematoxilina existen muchas formulaciones. Una de ellas es la de Ehrlich, que trascribo por si alguien se anima:

[Elaboración de la Hematoxilina Ehrlich: Disolver 1 g de Hematoxilina en: 50 ml de agua, 50 ml de glicerina, 1 ml de Acético, añadir 1 g de Alumbre potásico. Una vez disuelto dejarlo a la luz unas semanas, mejor un mes, y filtrar]

El Verde Rápido no actúa bien en medio acuoso. Funciona perfectamente en  Isopropanol o en mezcla de etanol e Isopropanol.













MODUS OPERANDI PARA COLORACIONES SIMPLES
 (UN SOLO COLORANTE):


1.- Pasar el corte del agua (suponiendo que esté ahí) a Isopropanol (no necesario si el colorante es acuoso). (2 minutos)

2.- Extraer el IPA o agua (no es necesario extraerlo totalmente)

3.- Añadir gotas de COLORANTE – (2 a 5 min. dependiendo del material y el colorante. ¡El verde rápido menos de 1 minuto!)

4.- Extraer el colorante e inmediatamente cubrir el corte con Isopropanol.

5.- Lavar con Isopropanol hasta que no haya cesión de colorante.

Comprobar al microscopio la corrección del teñido (sin dejar secar el corte)

6.- Montar en Laca (o pasar a montaje en medios “resinosos” según lo indicado anteriormente)

[ Un medio de montaje no acuoso barato y fácil de conseguir es el Poliestireno-Xilol. Basta disolver, hasta consistencia siruposa, trocitos de poliestireno expandido (Sí, el corcho blanco de bolitas de los embalajes) en Xilol. El poliestireno ha de ser blanco, no de color.]


En la mayoría de los casos será bueno poner un pequeño peso sobre el cubre mientras se seca el medio de montaje. Una pesa de granatario de pocos gramos o un tornillo grande hacen bien esta función.


En caso de que  en la comprobación tras el paso 5 de la tinción nos encontremos con una sobretinción, suele ser buen remedio lavar con agua, muy fugazmente, volviendo inmediatamente el corte al Isopropanol. La experiencia dirá el tiempo de lavado adecuado, que normalmente no superará el medio minuto.

Además de sobretinción pueden aparecer en la preparación cristales o precipitado del colorante. Se trata de una precipitación por cambio de disolvente y el remedio es el mismo: lavado BREVE con agua y vuelta al IPA.

En ocasiones, dependiendo del material que se estudie y el colorante, se pueden obtener coloraciones más o menos metacromáticas, unas fugaces y otras más permanentes. Los resultados dependerán de la suerte y la paciencia.

Aunque en estas coloraciones simples no se contraste con un segundo colorante, se puede jugar con la iluminación: campo oscuro, iluminación oblicua, polarización…

Breve nota sobre Utillaje conveniente:


- Frascos cuentagotas de unos 10-20 mL, o frascos sin  cuentagotas y cuentagotas aparte.

- Jeringas de insulina o de inyectables pequeñas para “sorber” los líquidos de los pocillos de coloración. También se pueden usar cuentagotas de punta fina e incluso trozos de papel de filtro.


 -Placa de coloración de porcelana o similar (puede valer un par de cucharillas de plástico de las que proporcionan los jarabes de farmacia pegadas a un soporte sólido o cualquier pieza cóncava que se pueda pegar a una base rígida).

Placa de gotas de porcelana

¡No compre un vidrio de reloj! ¡Le venderán uno grande, caro y poco práctico para estos menesteres! En su casa seguro que hay infinidad de artículos que pueden servir: Lo ya citado y mucho más. Por ejemplo esos vasitos pequeños de tomar chupitos que tienen el culo cóncavo, dados la vuelta. Pero ¡ojo!... eso no es disculpa para, a partir de ahora, tomarse el orujo a morro…

  

EJEMPLOS DE ÚTILES CASEROS PARA HACER TINCIONES

- Placa de Petri o pocillo donde ir tirando los líquidos sobrantes que luego irán a la pila o al lavabo. ¡Cuidado con las manchas!

   - Varillas de vidrio o plástico para agitar. (También sirven los palillos de dientes, que son baratos y    desechables)

Antonio Gracia Sanz            Madrid, febrero de 2.014.

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antongrasa@gmail.com