SOMERA REVISION de COLORANTES Y
ESTRUCTURA CELULAR
Cuando se habla de tinciones de vegetales se simplifica, se dice: las ligninas....las celulosas...
Esto no es más que una burda simplificación. La realidad, como siempre, es mucho más compleja.
La composición de la pared celular vegetal es un 75% agua e iones. El 25% restante constituye la parte propiamente estructural de la pared, con la siguiente composición:
Un tercio aproximadamente son celulosas: la celulosa es un polímero de celobiosa, que a su vez es un dímero formado por dos moléculas de glucosa (son las gruesas varillas amarillentas de la figura).
Otro tercio aproximadamente son hemicelulosas constituidas por xiloglicanos: polímeros de xilosa y otros monosacáridos (la maraña anaranjada).
Otro tercio aproximadamente son pectinas con calcio y grupos ácidos (la maraña azulado-verdosa). Estas son las principales responsables de la gelificación de las mermeladas.
Además hay un pequeño tanto por ciento de glicoproteinas, es decir, combinación de azúcares y proteínas.
La figura presenta la estructura de la pared vegetal según Sommerville et al (2004).
La lignificación consiste en que la lignina se introduce dentro de esa estructura rellenando los intersticios y creando nuevos enlaces que confieren una mayor rigidez al conjunto, además de crear menor solubilidad y proporcionar un sabor astringente si se ingiere.
Con esta complejidad estructural se comprende que es difícil teorizar sobre las interacciones entre un determinado colorante y una determinada zona de la pared celular.
Además, antes de proceder a la tinción, normalmente actuamos fisicoquímicamente sobre esas estructuras precisamente con intención de modificarlas.
En primer lugar, al someter los tejidos vegetales a FIJACION, hemos detenido los procesos metabólicos, lo cual nos garantiza que aquello que queremos estudiar no se va a descomponer, pero a la vez, hemos roto o modificado NO SABEMOS CUÁLES estructuras.
Los fijadores actúan desnaturalizando proteínas y/o creando nuevos enlaces entre los componentes celulares modificando así las estructuras que queremos observar. No olvidemos que en la pared celular hay proteínas (glicoproteinas) que pueden modificarse con el proceso de fijación.
A mayor abundamiento, la mayoría de las veces con el fin de observar mejor (más claramente) la estructura de los tejidos (de sus paredes celulares), hacemos un tratamiento con lejía para destruir los contenidos celulares.
Esa LEJIACIÓN consiste en una brutal oxidación a pH alto que lógicamente destroza citoplasmas (contenidos celulares). ¿Hasta qué punto altera a la matriz de la pared celular cuyo 75% es agua? También suponemos que no afecta para los efectos que nos ocupan, es decir, estructura general y coloración de estructuras generales.
Las estructuras varían de especie a especie, de zona a zona y en los distintos estadios de crecimiento de una misma planta, con lo cual no hemos de extrañarnos si obtenemos distintas tinciones de una planta en distintas ocasiones.
Lo dicho explica que, aunque el modus operandi y los reactivos sean los mismos, podamos obtener una coloración con precioso contraste en una preparación de un tallo de una especie vegetal y sin embargo con el tallo de otra especie diferente el contraste sea casi inexistente, e incluso puede darse el caso de obtener, en distintas ocasiones, preparaciones de una misma planta con resultados paradójicos en cuanto a la coloración obtenida.
Modificando modus operandi, concentraciones, tiempos... quizá podamos compensar las diferencias y obtener resultados más parecidos con tallos de distintas especies y/o con distintos tallos de diferentes zonas de una misma planta, e incluso con tallos de una misma planta recolectados en distinta época.
Sin embargo, sí que es cierto que se encuentran regularidades en el reparto y disposición de los tejidos para cada especie, género, familia.
Con respecto a la estructura y composición de materias colorantes el asunto también es complejo, aunque no tanto, ya que se trata de estructuras químicas más simples.
Los colorantes actúan en función de: su tamaño molecular, su forma, su reparto de cargas eléctricas, su polaridad, su solubilidad, su viscosidad, la temperatura, el tiempo de acción, la agitación, la concentración, el orden de actuación, etcétera.
Además el resultado depende también del medio de inclusión que utilicemos para montar la preparación definitiva, pues unos medios son idóneos y duraderos (tanto el medio como la estabilidad de los colores) y otros en cambio son fugaces tanto en la conservación de los colores como en la estabilidad del medio y sus burbujas.
La elaboración de una preparación de un corte vegetal coloreado es una cadena de muchos eslabones y en cada uno de ellos podemos actuar incorrectamente y arruinar el resultado final.
¡¿Quizá aquí radica la gracia de esta afición.!?
La cadena más o menos podría ser:
Colecta y troceo de muestras
Conservación y etiquetado
en seco (sobres, herbario...)
en medio conservador (alcohol, FAA...)
Fijación
Corte (con inclusión, si procede, en parafina, PEG, médula...) Coloración
Montaje en porta-cubre
Conservación y etiquetado final
Observación
Fotografiado
Archivo fotográfico
Paso ahora a repasar sólo alguno de los anteriores pasos:
A) COLORANTES y sus TÉCNICAS de TINCIÓN:
a) Preferentes de ligninas:
SAFRANINA (da tono rojo en medio acuoso y morado en hidroalcohólico)
FUCSINA BÁSICA
VERDE YODO, V. BRILLANTE, V.MALAQUITA
VIOLETA DE GENCIANA
AZUL de METILENO ¡ojo!: Langeron dice que tiñe la celulosa, y es cierto, quizá sea el único que la tiñe ESPECÍFICAMENTE, pero también tiñe otras muchas cosas (casi todo...)
b) Preferentes de celulosas (y pectinas y hemicelulosas...):
ROJO CONGO (montaje casi obligado: Pujiula) **
AZUL ASTRA en medio acuoso
** [ Se puede intentar el paso BRUSCO a IPA: dejar casi secar el corte ya teñido por ROJO CONGO y verter encima gotas de IPA, lavar fugazmente con más IPA y seguir montaje con IPA – Xilol- -Bálsamo. Tiene la ventaja de la rapidez. Si hay suerte, el RC queda algo pardo y quizá el verde sea estable...]
Los del grupo a) tiñen también las celulosas ( y pectinas y hemicelulosas más o menos), pero es fácil diferenciar con agua, solución de pH ácido o alcohol clorhídrico hasta dejar sólo teñidas las partes lignificadas.
También los del grupo b) tiñen todo, pero se usan al final, cuando ya se ha diferenciado después de teñir lo lignificado.
TÉCNICAS DE TINCIÓN
B) MEDIOS DE INCLUSION
1- ACUOSOS:
Gomas y Gomas-glicerinas: Se llevan mal con la Safranina, que destiñe, pero van bien con el Rojo Congo.
Silicato sódico: respeta colores, pero la experiencia de momento es de solo dos meses de conservación. He utilizado Silicato sódico adquirido en “Riesgo” (un litro, menos de 5 €).
Solamente he tenido hasta ahora una experiencia negativa con el silicato: una preparación montada con Silicato 3:1 en agua generó a la semana una especie de “craquelado”, sobretodo en las células meristemáticas grandes.
2- RESINOSOS: (todos disueltos en xilol)
Bálsamo y Dammar: Lo mejor para evitar burbujas y garantizar conservación durante años. No respeta Rojo Congo.
Paraloid: puede sustituir al Bálsamo y Dammar en algún caso.
[ Desde que descubrí el IPA como disolvente en microscopía me olvidé de los pasos por alcoholes de graduación creciente (50-70-96-absoluto) y decreciente para deshidratar e hidratar, y de las esencias de clavo o naranja. (ver en otras entradas del blog) ]
3-MIXTOS:
Pujiula: El único que respeta la tinción Verde Yodo - Rojo Congo. El inconveniente es que se ha de disponer de una noche para que seque la goma. Por propia experiencia se garantiza duración de más de 30 años.
SIMPLIFICANDO...
Para el que no quiera fabricarse mezclas colorantes del tipo de SAVI o FA-11 y que no quiera ampliar mucho la gama de colorantes empleados, indico reactivos y modus operandi para realizar preparaciones sencillas de cortes vegetales, rápidas y con un buen contraste:
A) COLORANTES:
SAFRANINA ACUOSA: Solución acuosa 0,2-0,5%
VERDE ( Malaquita, Yodo, Brillante, es casi indiferente): Solución acuosa 0,1-0,5%
AZUL DE ASTRA: “Euromex” (único al que he tenido acceso)
FUCSINA ÁCIDA: Solución al 0,1-0,2% en AGUA-IPA a partes iguales.
B) MEDIOS DE INCLUSIÓN:
BÁLSAMO del Canadá en Xilol (hasta consistencia siruposa) . Igualmente DAMMAR.
SILICATO sódico: 4 partes de silicato comercial + 1 parte de agua.
C) DISOLVENTES:
IPA: Isopropanol
IPAXIL: Isopropanol y Xilol a partes iguales
XILOL
Disolución ácida (pH2 ) : disolver 2 mL de “Salfumant” reciente (HCl) en un litro de agua.
D) MODUS OPERANDI DE COLORACIONES:
SAFRANINA:
Corte en agua
SAFRANINA ACUOSA 5 minutos
Lavado en agua (no muy prolongado)
Montar en SILICATO
Resultado: Ligninas pardas y celulosas amarillas:
SAFRANINA – ASTRA:
Corte en agua
SAFRANINA ACUOSA 5 minutos
Agua hasta no cesión (diferenciar con pH 2 si no queda limpia la celulosa)
AZUL DE ASTRA 3 minutos
Agua hasta no cesión
Montar en Silicato
Resultado: Ligninas rojas y celulosas azules:
En lugar de la solución de Azul de Astra se puede utilizar una mezcla a partes iguales de Azul de Astra y Orange (ambos “Euromex”), con lo que la coloración queda más verdosa y menos azulada.
VERDE – FUCSINA ÁCIDA:
Corte en agua
VERDE (BRILLANTE, MALAQUITA...) 5 minutos
pH2 hasta diferenciar
IPA
FUCSINA ÁCIDA 3-5 minutos
IPA
IPAXIL
Montar en Bálsamo
Resultado: Ligninas verdeazuladas y celulosas fucsia (el aspecto final recuerda al obtenido con la tinción de Román: Verde Yodo/Ehrlich):
Tanto las proporciones de los colorantes como los tiempos son orientativos, dependiendo de: el material que se trabaje, grosor de corte, temperatura, agitación, etc.
Como puede verse, con NO MÁS DE UNA DECENA de frasquitos pueden hacerse con facilidad y rapidez preparaciones duraderas en el tiempo y con contraste variado. El silicato se ha mostrado estable y durable más de dos meses, habrá que esperar más tiempo para comprobar su comportamiento, ya que yo no lo he manejado antes ni tengo referencia alguna.
Todos los cortes se han obtenido con el “Microtomo Estocástico” (ver entrada correspondiente).
__________________
SEGUIMIENTO DE COLORANTES: Respecto a las mezclas colorantes ya referenciadas antes en otras enttradas del blog, se puede decir que:
SAVI ya lleva casi 4 años funcionando bien, y
FA-11 casi un año.
Febrero, 2,018
Con esta complejidad estructural se comprende que es difícil teorizar sobre las interacciones entre un determinado colorante y una determinada zona de la pared celular.
Además, antes de proceder a la tinción, normalmente actuamos fisicoquímicamente sobre esas estructuras precisamente con intención de modificarlas.
En primer lugar, al someter los tejidos vegetales a FIJACION, hemos detenido los procesos metabólicos, lo cual nos garantiza que aquello que queremos estudiar no se va a descomponer, pero a la vez, hemos roto o modificado NO SABEMOS CUÁLES estructuras.
Los fijadores actúan desnaturalizando proteínas y/o creando nuevos enlaces entre los componentes celulares modificando así las estructuras que queremos observar. No olvidemos que en la pared celular hay proteínas (glicoproteinas) que pueden modificarse con el proceso de fijación.
A mayor abundamiento, la mayoría de las veces con el fin de observar mejor (más claramente) la estructura de los tejidos (de sus paredes celulares), hacemos un tratamiento con lejía para destruir los contenidos celulares.
Esa LEJIACIÓN consiste en una brutal oxidación a pH alto que lógicamente destroza citoplasmas (contenidos celulares). ¿Hasta qué punto altera a la matriz de la pared celular cuyo 75% es agua? También suponemos que no afecta para los efectos que nos ocupan, es decir, estructura general y coloración de estructuras generales.
Las estructuras varían de especie a especie, de zona a zona y en los distintos estadios de crecimiento de una misma planta, con lo cual no hemos de extrañarnos si obtenemos distintas tinciones de una planta en distintas ocasiones.
Lo dicho explica que, aunque el modus operandi y los reactivos sean los mismos, podamos obtener una coloración con precioso contraste en una preparación de un tallo de una especie vegetal y sin embargo con el tallo de otra especie diferente el contraste sea casi inexistente, e incluso puede darse el caso de obtener, en distintas ocasiones, preparaciones de una misma planta con resultados paradójicos en cuanto a la coloración obtenida.
Modificando modus operandi, concentraciones, tiempos... quizá podamos compensar las diferencias y obtener resultados más parecidos con tallos de distintas especies y/o con distintos tallos de diferentes zonas de una misma planta, e incluso con tallos de una misma planta recolectados en distinta época.
Sin embargo, sí que es cierto que se encuentran regularidades en el reparto y disposición de los tejidos para cada especie, género, familia.
Con respecto a la estructura y composición de materias colorantes el asunto también es complejo, aunque no tanto, ya que se trata de estructuras químicas más simples.
Los colorantes actúan en función de: su tamaño molecular, su forma, su reparto de cargas eléctricas, su polaridad, su solubilidad, su viscosidad, la temperatura, el tiempo de acción, la agitación, la concentración, el orden de actuación, etcétera.
Además el resultado depende también del medio de inclusión que utilicemos para montar la preparación definitiva, pues unos medios son idóneos y duraderos (tanto el medio como la estabilidad de los colores) y otros en cambio son fugaces tanto en la conservación de los colores como en la estabilidad del medio y sus burbujas.
La elaboración de una preparación de un corte vegetal coloreado es una cadena de muchos eslabones y en cada uno de ellos podemos actuar incorrectamente y arruinar el resultado final.
¡¿Quizá aquí radica la gracia de esta afición.!?
La cadena más o menos podría ser:
Colecta y troceo de muestras
Conservación y etiquetado
en seco (sobres, herbario...)
en medio conservador (alcohol, FAA...)
Fijación
Corte (con inclusión, si procede, en parafina, PEG, médula...) Coloración
Montaje en porta-cubre
Conservación y etiquetado final
Observación
Fotografiado
Archivo fotográfico
Paso ahora a repasar sólo alguno de los anteriores pasos:
A) COLORANTES y sus TÉCNICAS de TINCIÓN:
a) Preferentes de ligninas:
SAFRANINA (da tono rojo en medio acuoso y morado en hidroalcohólico)
FUCSINA BÁSICA
VERDE YODO, V. BRILLANTE, V.MALAQUITA
VIOLETA DE GENCIANA
AZUL de METILENO ¡ojo!: Langeron dice que tiñe la celulosa, y es cierto, quizá sea el único que la tiñe ESPECÍFICAMENTE, pero también tiñe otras muchas cosas (casi todo...)
b) Preferentes de celulosas (y pectinas y hemicelulosas...):
ROJO CONGO (montaje casi obligado: Pujiula) **
AZUL ASTRA en medio acuoso
VERDE RÁPIDO: solo actúa en medio apolar (IPA)
HEMATOXILINA (Ehrlich)
FUCSINA ÁCIDA en IPA-agua ** [ Se puede intentar el paso BRUSCO a IPA: dejar casi secar el corte ya teñido por ROJO CONGO y verter encima gotas de IPA, lavar fugazmente con más IPA y seguir montaje con IPA – Xilol- -Bálsamo. Tiene la ventaja de la rapidez. Si hay suerte, el RC queda algo pardo y quizá el verde sea estable...]
Los del grupo a) tiñen también las celulosas ( y pectinas y hemicelulosas más o menos), pero es fácil diferenciar con agua, solución de pH ácido o alcohol clorhídrico hasta dejar sólo teñidas las partes lignificadas.
También los del grupo b) tiñen todo, pero se usan al final, cuando ya se ha diferenciado después de teñir lo lignificado.
TÉCNICAS DE TINCIÓN
COLORANTE MEDIO DE
INCLUSION
I-Simples:
HEMATOXILINA Bals para epidermis
II-Dobles con diferenciación:
VERDE YODO*- ROJO CONGO Pujiula
SAFRANINA - ASTRA Silic
SAFRANINA - HEMATOXILINA Bals Silic no siempre el contraste es óptimo
VERDE YODO - HEMATOXILINA Bals
* (Casi siempre el VERDE YODO es sustituible por otros verdes: Brillante, Malaquita.)
* (Casi siempre el VERDE YODO es sustituible por otros verdes: Brillante, Malaquita.)
III-Metacromáticas: (puede haber sorpresas: poco contraste, fugacidad, colores raros...)
SAFRANINA acuosa Silic a veces bonita metacromasia
AZUL TOLUIDINA acuoso Silic
AZUL METILENO acuoso Silic o Bals produce metacromasia fugaz
VERDE YODO Bals
IV-Dobles con mezclas colorantes: (Tratados en otras entradas del Blog. Ver seguimiento al final)
SAVI (SA en agua + VR en IPA)
FA11 (FS básica + ASTRA en agua)
1- ACUOSOS:
Gomas y Gomas-glicerinas: Se llevan mal con la Safranina, que destiñe, pero van bien con el Rojo Congo.
Silicato sódico: respeta colores, pero la experiencia de momento es de solo dos meses de conservación. He utilizado Silicato sódico adquirido en “Riesgo” (un litro, menos de 5 €).
Solamente he tenido hasta ahora una experiencia negativa con el silicato: una preparación montada con Silicato 3:1 en agua generó a la semana una especie de “craquelado”, sobretodo en las células meristemáticas grandes.
¿Alguien tiene experiencia con el Silicato
como medio de montaje?
como medio de montaje?
2- RESINOSOS: (todos disueltos en xilol)
Bálsamo y Dammar: Lo mejor para evitar burbujas y garantizar conservación durante años. No respeta Rojo Congo.
Paraloid: puede sustituir al Bálsamo y Dammar en algún caso.
[ Desde que descubrí el IPA como disolvente en microscopía me olvidé de los pasos por alcoholes de graduación creciente (50-70-96-absoluto) y decreciente para deshidratar e hidratar, y de las esencias de clavo o naranja. (ver en otras entradas del blog) ]
3-MIXTOS:
Pujiula: El único que respeta la tinción Verde Yodo - Rojo Congo. El inconveniente es que se ha de disponer de una noche para que seque la goma. Por propia experiencia se garantiza duración de más de 30 años.
SIMPLIFICANDO...
Para el que no quiera fabricarse mezclas colorantes del tipo de SAVI o FA-11 y que no quiera ampliar mucho la gama de colorantes empleados, indico reactivos y modus operandi para realizar preparaciones sencillas de cortes vegetales, rápidas y con un buen contraste:
A) COLORANTES:
SAFRANINA ACUOSA: Solución acuosa 0,2-0,5%
VERDE ( Malaquita, Yodo, Brillante, es casi indiferente): Solución acuosa 0,1-0,5%
AZUL DE ASTRA: “Euromex” (único al que he tenido acceso)
FUCSINA ÁCIDA: Solución al 0,1-0,2% en AGUA-IPA a partes iguales.
B) MEDIOS DE INCLUSIÓN:
BÁLSAMO del Canadá en Xilol (hasta consistencia siruposa) . Igualmente DAMMAR.
SILICATO sódico: 4 partes de silicato comercial + 1 parte de agua.
C) DISOLVENTES:
IPA: Isopropanol
IPAXIL: Isopropanol y Xilol a partes iguales
XILOL
Disolución ácida (pH2 ) : disolver 2 mL de “Salfumant” reciente (HCl) en un litro de agua.
D) MODUS OPERANDI DE COLORACIONES:
SAFRANINA:
Corte en agua
SAFRANINA ACUOSA 5 minutos
Lavado en agua (no muy prolongado)
Montar en SILICATO
Resultado: Ligninas pardas y celulosas amarillas:
 |
| Tallo de hipérico teñido con Safranina acuosa (en Silicato) |
SAFRANINA – ASTRA:
Corte en agua
SAFRANINA ACUOSA 5 minutos
Agua hasta no cesión (diferenciar con pH 2 si no queda limpia la celulosa)
AZUL DE ASTRA 3 minutos
Agua hasta no cesión
Montar en Silicato
Resultado: Ligninas rojas y celulosas azules:
 |
| Tallo de hipérico teñido con Safranina acuosa y Astra (en Silicato) |
En lugar de la solución de Azul de Astra se puede utilizar una mezcla a partes iguales de Azul de Astra y Orange (ambos “Euromex”), con lo que la coloración queda más verdosa y menos azulada.
VERDE – FUCSINA ÁCIDA:
Corte en agua
VERDE (BRILLANTE, MALAQUITA...) 5 minutos
pH2 hasta diferenciar
IPA
FUCSINA ÁCIDA 3-5 minutos
IPA
IPAXIL
Montar en Bálsamo
Resultado: Ligninas verdeazuladas y celulosas fucsia (el aspecto final recuerda al obtenido con la tinción de Román: Verde Yodo/Ehrlich):
 |
| Tallo de hipérico teñido con Verde Malaquita y Fucsina ácida (en Bálsamo) |
Tanto las proporciones de los colorantes como los tiempos son orientativos, dependiendo de: el material que se trabaje, grosor de corte, temperatura, agitación, etc.
Como puede verse, con NO MÁS DE UNA DECENA de frasquitos pueden hacerse con facilidad y rapidez preparaciones duraderas en el tiempo y con contraste variado. El silicato se ha mostrado estable y durable más de dos meses, habrá que esperar más tiempo para comprobar su comportamiento, ya que yo no lo he manejado antes ni tengo referencia alguna.
Todos los cortes se han obtenido con el “Microtomo Estocástico” (ver entrada correspondiente).
__________________
SEGUIMIENTO DE COLORANTES: Respecto a las mezclas colorantes ya referenciadas antes en otras enttradas del blog, se puede decir que:
SAVI ya lleva casi 4 años funcionando bien, y
FA-11 casi un año.
Febrero, 2,018
