CONFECCIÓN DE CORTES, EPIDERMIS y TRICOMAS

OBSERVACIÓN DE TRICOMAS

Hoy toca observar tricomas

Es decir, pelos. Los pelos de los vegetales, que tienen la misma función que los pelos en los animales: la protección.

Protección frente a luz, a viento, a frío, a herbívoros, a insectos, artrópodos o gusanos que intenten penetrar para vivir o para desovar...

Pelos los tienen muchos vegetales, y no todos son iguales. Los hay tectores, glandulosos, lisos, rugosos, ramificados, mono y pluricelulares, estrellados...

Por eso vale la pena observarlos al microscopio.

En su composición entra la celulosa, la lignina, la cutina, la suberina...

Lo mejor será observarlos in situ, en la misma planta, ya que así se aprecia también su arranque, el lugar donde se implantan, que suele tener un grupo de células diferentes del resto, pero habremos de acercarnos bastante ya que su tamaño suele ser pequeño. Nos movemos en las escalas propias de la fotografía cercana (eso que llaman close-up) y de la macrofotografía, cuando no en la fotomicrografía.

Los podemos observar sin teñir

Mercurialis tomentosa sin teñir

Se pueden ver bien en cortes gruesos, que podemos realizar a mano con facilidad, tanto en tallos como en hojas. En los bordes de los cortes transversales podremos observar, en distintos planos, los tricomas. No podremos enfocar todos a la vez, ya que el corte es grueso, pero lo que interesa es poder recrearnos en la observación de cada uno por separado

Corte transversal de tallo de Veronica

También es interesante la observación con luz incidente, bien con la ayuda de un estereomicroscopio de pocos aumentos o bien fotografiándolos con los móviles actuales, que son capaces de enfocar a pocos centímetros.

Superficie de hoja de Lavandula 
(se ven también glándulas de esencia redondeadas amarillas)

Podemos observarlos teñidos. Como suelen resistirse a tomar los colorantes, la parte parenquimatosa del corte quedará sobre-teñida, cosa que no nos importa ya que nuestra atención se dirige a los tricomas.

Pelo tector y glanduloso de Pelargonium (Azul de Metileno)

Puede interesar algunas veces observar los pelos individualizados, arrancados de su sitio.

Pelo tector rugoso de Origanum

Pasemos ahora a los MODUS OPERANDI para realizar lo arriba indicado.

Tres métodos:
          A) Por fotografía cercana
          B) En cortes transversales (al aire, en líquido o teñidos)
          C) Individualizados (arrancados)

Veamos cada uno de ellos:

A) FOTOGRAFÍA CERCANA:

Hoy en día se puede hacer con facilidad con los nuevos móviles, que fotografían a distancias muy cortas (entre 5 y 10 cm). Lo interesante es dar con la iluminación adecuada que resalte lo que se quiera observar en la muestra.

Haz de hoja de Veronica (foto con móvil)

Haz de hoja de Oxalis (foto con móvil)

Una caja o un vaso puede ser un soporte válido para sostener el móvil. 

Móvil sobre un vaso fotografiando una hoja
(así nos ahorramos comprar soportes sofisticadísimos...)

La iluminación se puede intentar con una linterna o un pequeño “flexo”. (También hay iluminadores muy buenos si queremos gastarnos las perras...). La iluminación se ha de hacer a base de pruebas, pero siempre será bueno efectuar iluminaciones laterales que incrementen el relieve.

Tallo de Veronica (luz incidente)

Es conveniente que el móvil permita ajustar MANUALMENTE su cámara, aunque a veces los métodos automáticos son válidos. Para evitar vibraciones podemos usar el disparo diferido unos segundos.

Las muestras deberán ser “frescas” para que los tricomas no hayan perdido su turgencia y por lo tanto mantengan su natural porte.

B) EN CORTES:

Se realiza, a mano alzada, un corte transversal de tallo u hoja, y se deposita sobre un porta.

B-1: al aire

Se puede hacer la observación AL AIRE (incluso sin poner cubre), que será la manera más natural de observación.

La observación se puede hacer con luz incidente y fondo claro o fondo oscuro, o también con luz transmitida (la del iluminador del microscopio).

Pelos glandulosos de Antirrhinum (fondo oscuro, luz lateral)

Pelos tectores y glandulosos de Pelargonium 
en corte transversal grueso, luz transmitida.

Este sistema tiene el inconveniente de ser un método TEMPORAL, ya que antes o después el corte se deteriora

B-2: en medio líquido

Se puede sumergir el corte ( y por tanto los pelos) en un líquido y cubrir con el correspondiente cubreobjetos. El agua y los líquidos no oleosos (glicerina, goma arábiga...) darán más contraste que los oleosos (alcoholes, resinas...). Si se quiere hacer una preparación permanente, habrá que proceder a FIJAR el corte y por tanto es necesario añadir alcohol u otro fijador. Esto puede deteriorar (o no) los tricomas. Muchas veces estas manipulaciones hacen que “exploten” y se deshinchen las células glandulosas redondas.

Una vez fijado, se puede incluir el corte. Si se hace en agua habrá que sellar los bordes del cubre con laca para evitar que el agua se evapore. El agua como medio de inclusión casi siempre genera burbujas que acostumbran a colocarse en los lugares más inoportunos (ver foto de Romero al final).  Mejor es incluir en laca o resinas, pero en este caso el contraste se reduce mucho y es necesario teñir, cosa de la que nos ocupamos enseguida. Un sistema intermedio es incluir en medios acuosos que secan después, como Apathy o Farrán.

Pelargonium en medio acuoso, luz transmitida.

B-3: tiñendo

La tinción del corte (con los pelos) se hace como siempre por inmersión en el colorante (luego enumeraremos algunos). Normalmente se ha de prolongar el tiempo de inmersión ya que los tricomas son reacios a tomar color. No solo reacios sino también irregulares en la coloración, ya que en un mismo campo podemos tener a veces pelos teñidos y pelos no teñidos, aún tratándose de pelos de una misma planta y tipo, e incluso parte del pelo teñido de un color y parte de otro color.

Al prolongar el tiempo de tinción (ya se ha apuntado antes) el parénquima del corte quedará sobre-tintado, dado que además no hemos tenido especial cuidado en hacer cortes finos.

Pelargonium, Azul de metileno. Pelos tectores largos
y pequeños pelos glandulosos. Corte grueso.

Lavaremos con disolvente adecuado hasta no cesión y montaremos en laca o resina.

    C) INDIVIDUALMENTE:

Si queremos observar los pelos individualmente, podemos proceder a raspar con una cuchilla o lanceta la superficie de la planta, haciendo caer los pelos sobre un porta horizontal. Esta operación es relativamente fácil con pelos rígidos pero difícil con pelos blandos y largos: rascaremos la superficie y los pelos se “peinarán” y acomodarán al paso de la cuchilla para luego volver a la posición original sin caer al porta. 
Además este método tiene el inconveniente de ver solo el pelo una vez arrancado sin observar su inserción en la planta, que suele ser interesante.

Una vez hemos conseguido un montoncito de pelos en el porta (habrá que recuperar los que se empeñan en pegarse a la cuchilla), podemos poner encima una gota de colorante y colocar el cubre.

Dejamos actuar unos minutos (normalmente más de los que pensábamos) y ahora debemos sustituir el colorante por disolvente incoloro. 

Modo de introducir líquido por la derecha mientras se extrae por la izquierda con el papel de filtro.

Lo “chuparemos” por capilaridad por un lado del cubre con un trocito de papel de filtro mientras por el otro lado agregamos gotas de disolvente (agua, alcohol...). Normalmente los tricomas aguantan sin escaparse hacia el papel de filtro.

Pelo estrellado. Tinción con Safranina. Luz transmitida. 

Pelo estrellado. Tinción Verde Malaquita. Luz transmitida.

Si el colorante no es muy oscuro puede obviarse la operación anterior, y puede que el colorante acabe por concentrarse en los tricomas dejando el resto del campo casi sin color.

Una vez sustituido el colorante por disolvente se puede optar por:

a) Sellar con laca (Ya se comentó antes el inconveniente del agua como medio permanente.)

b) Sustituir el disolvente por un medio de montaje definitivo valiéndonos del mismo método: “chupar” por un lado mientras aportamos disolvente por el opuesto. Como los medios de montaje suelen ser viscosos, podemos usar medios diluidos con el disolvente adecuado: IPA para Laca; Xilol para Bálsamo.

El cubreobjetos puede mantenerse fijo aplicando en su centro un pequeño peso: pesita de 2 gramos, tornillo, etc.

En algunos casos (SOLO SI SON PELOS GRANDES Y ABUNDANTES) puede intentarse el método consistente en teñir en el hueco de una placa de gotas o similar y después “colar” los pelos teñidos por un colador que habremos fabricado pegando un trozo de gasa muy fina en un alvéolo de un blister de los que contienen los comprimidos o algo similar. Mejor que gasa es un trozo de media o “panty” vieja (también sirve una nueva pero es más caro). Para evitar manchas será bueno recoger los líquidos de lavado en un frasquito y luego tirarlos al sumidero debidamente.

"Colador" hecho con trozo de media y alveolo de
blister de comprimidos.

"Colador" y frasco "sumidero".

Los tricomas se lavan sobre el mismo “colador” con el disolvente adecuado y se recuperan los pelos teñidos a favor de un pincelito, depositándolos en un porta y tratándolos como antes se ha dicho.

En todos los procesos explicados es fundamental estar muy atento a corrientes de aire, estornudos, suspiros, etc., que pueden dar al traste con nuestra preparación. Lo mejor es no respirar... 

¡pero es que nos va la vida en ello... !

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COLORANTES:

Con los colorantes habituales tendremos cubierta toda la gama apetecible, ya que, insistiendo más o menos, acabarán tiñéndose lo suficiente. (Algunos se resisten bastante).

Verde: Con Verde Brillante, Verde Malaquita,  Verde Yodo

Azul: Con Azul de Metileno, Azul de Astra, Azul de Toluidina

Rojo: Con Safranina

Morado: Con Hematoxilina, Violeta de Genciana, Fucsina básica

Con estos colorantes se pueden teñir (o intentarlo) los cortes y/o tricomas antes citados. El tiempo de tinción, dependiendo del colorante, puede ser alto, mayor de cinco minutos, con lo que el corte quedará oscurísimo (ya hemos dicho que son cortes gruesos) pero lo que nos interesa son los pelos.

Concentraciones:

Conviene usar concentraciones altas (1%) y será necesario prolongar los tiempos (10 min). La consecuencia lógica es que habrá que insistir en los lavados para que deje de haber cesión de colorante.

Mezclas de colorantes:

Los ya conocidos en este blog:

SAVI: Safranina y Verde Rápido

SASIP: Safranina acuosa y Azul Astra en IPA

SAAS: Safranina hidroalcoholica yAzul Astra

FA 11: Fucsina acuosa y Azul Astra (éste es nuevo)

Visto el comportamiento físico-químico de alguno de ellos (producción de precipitados), me quedo solo con SAVI y FA11 (a la espera del comportamiento de este último con el tiempo).

 Algunas plantas de fácil localización que ofrecen tricomas interesantes:

Lavandula: lavanda, espliego

Sin teñir

Pelargonium: los geranios de los tiestos decorativos

Azul de Metileno

Rosmarinus: romero

Safranina. La región inferior es una burbuja,
en la que condensan pequeñas gotitas de agua,

Antirrhinum: conejitos o dragoncillos

Luz transmitida. Sombras y suciedad, ya que los "conejitos"
son bastante pringosos.

Quercus: encina

Tinción SASIP. Abajo, en el envés, los tricomas,
de perfil y caprichosamente teñidos.
Corte de transversal de hoja 

Sin tinción

Verbascum: gordolobo

Envés de hoja. Luz incidente.

Olea: olivo

Corte de tallo. Tinción FA 11.
El pelo del círculo rojo se observa de perfil.

El pelo de Olea es el central redondeado, visto de frente.
El largo es de Mercurialis, ligeramente teñido de Safranina.
Los otros son de Lavandula.

También se puede disfrutar de los tricomas sin teñir visualizándolos con ayuda de la POLARIZACIÓN, pero eso a lo mejor lo tratamos otro día, con más calma...

(Todas las fotografías, y sus correspondientes preparaciones y tinciones, son del autor).

EPIDERMIS y CORTES

Hace un tiempo redacté, para unos amigos, un "Manual rudimentario del microscopista vegetal aficionado".

Por si es de utilidad para algún principiante, colgaré aquí alguna sección del mismo, con pequeñas modificaciones. No contienen estas páginas ningún descubrimiento especial, sino recopilación de datos de otros autores y aportación de alguna experiencia personal.

Bien: No parece que esté muy puesto en esto de insertar PDF, pero creo que se puede leer.

MÁS SOBRE EPIDERMIS

Además de los métodos de "pellizco" y de maceración de tejidos para la obtención de epidermis vegetales, hay otro método indirecto para disponer de la estructura de las epidermis vegetales ( y si queremos también de las animales, p. ej. huella dactilar).

Se trata del conocido método de obtener la réplica de la superficie, es decir, sacar un molde de ella.

Para ello, basta con pincelar laca de uñas en la superficie de la hoja o tallo ( una superficie de 0,5x0,5 cm es suficiente), esperar a que se seque, y separar la superficie de laca. Colocando hacia arriba en un porta la plaquita obtenida podremos observar casi todos los detalles de la epidermis.

El montaje en el porta no debe hacerse con laca, pues la misma disolvería la réplica obtenida. Tampoco con medios que puedan disolver el producto que se haya utilizado para confeccionar la réplica. Lo ideal es hacer un montaje AL AIRE, colocando un cubreobjetos sobre la réplica sin apretar demasiado y fijando dicho cubre con cuatro gotitas de laca en las cuatro esquinas del cubre. La laca o el pegamento de estas gotitas interesa que sea bastante viscosa, con el fin de que solidifique rápidamente y no fluya por debajo del cubre  interfiriendo o disolviendo la réplica. Mejor que no sea laca sino un producto que no contenga el mismo disolvente que la laca, por ejemplo goma arábiga o pegamento de uso escolar.

También puede probarse el montaje en agua, que hará desaparecer ciertos detalles pero permitirá observar otros más delicados. El medio de montaje ha de ser de índice de refracción lo más distinto posible al del producto con el que se ha obtenido la réplica y de composición tal que no la disuelva o perjudique.

En vez de laca para obtener la réplica puede usarse cualquier otro pegamento, pero ha de cuidarse que una vez seco quede lo suficientemente rígido como para que no se estire el material al separarlo de la hoja, ya que esa deformación modificaría la estructura obtenida.

¡Cuidado con el calor! Yo puse a secar una réplica bajo el calor de un flexo encendido con el fin de  que las cuatro gotitas se secaran rápidamente, y ese calor fue suficiente para fundir parcialmente el material de la réplica, quedando todo liso...

Hay que tener en cuenta que lo que se obtiene es un "negativo" de la superficie a estudiar. Donde observemos un hueco, corresponde a un bulto de la hoja y viceversa. Es como si hiciéramos un flan de arena en la playa con un cubo, y en vez de observar el flan de arena realizado, viéramos el hueco del cubo. Esto normalmente no tiene importancia, a no ser que en la estructura estudiada haya objetos con asimetría espacial. (Por ejemplo, la impresión obtenida de una mano derecha será una mano izquierda).

Este método es aplicable a cualquier superficie LIMPIA (si está sucia se puede limpiar con Alcohol o Isopropanol previamente), pero no es aplicable a superficies con mucha pilosidad, pues al sacar la réplica arrancaremos todo.

Podemos aumentar el contraste y belleza de estas superficies jugando con iluminaciones de tipo Campo Oscuro e Iluminación Oblicua, pero esto lo trataremos en otra entrada.